مراحل کشت بافت گیاهان (آموزش کامل)

مراحل کشت بافت گیاهان (آموزش کامل)

مشاهده فهرست

چکیده : کشت بافت یک روش مهندسی ژنتیک است که از طریق آن یک سلول یا بافت از یکی از اندام های گیاهی را جدا کرده و درون بستر مناسب و محیط کشت قرار می دهند تا در اثر تغذیه و رشد آن از مواد غذایی موجود در محیط کشت یک گیاه کامل حاصل آید. یکی از کاربردهای مهمی که باعث می‌ شود تکنیک کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد ، تکثیر و ازدیاد گونه‌ های در حال انتقراض و مقاوم است.

واژه های کلیدی : کشت بافت ، مهندسی ژنتیک ، محلول سازی ، عناصر میکرو ، عناصر ماکرو ، محلول آهن ، محلول ویتامین ها ، کشت اندام ، کشت جنین ، کشت کالوس ، تنظیم کننده های رشد ، تجهیزات آزمایشگاهی ، پی اچ (ph)، آگار ، جامد کننده محیط کشت ، استریل کردن

مقدمه:

کشت بافت چیست؟

کشت بافت یکی از روش های مهندسی ژنتیک است که از راه آن یک سلول یا بافت از یکی از اندام های گیاهی را درون بستر مناسب و محیط کشت قرار می دهند تا در اثر تغذیه و رشد آن یک گیاه کامل حاصل آید.

بافت در واقع مجموعه‌ ای از سلول‌ های اندام‌ های گیاهی را تشکیل می‌ دهد و البته به‌ طور کلی این کلمه برای همه موجودات زنده مورد استفاده قرار می‌ گیرد . بافتی که برای کشت انتخاب می‌ شود باید از هر گونه بیماری سالم باشد و در واقع بخشی باشد که لیاقت کامل شدن و تبدیل شدن به گیاه کامل را داشته باشد.

چرا کشت بافت؟

یکی از کاربردهای مهمی که باعث می‌ شود تکنیک کشت بافت مورد استفاده قرار گیرد ، تکثیر و ازدیاد گونه‌ های مقاوم و مفید هستند . جذابیتی که این روش از تکثیر دارد تبدیل یک گیاه کامل از بافتی کوچک است . بستر کشت در این روش محیطی سرشار از مواد غذایی است تا بتواند بافت مورد نظر را تا زمانی که بتواند گلیم خود را از آب بیرون بکشد ، تغذیه کند.

فضای مورد استفاده برای کشت بافت ، محیطی بسته و راکد است و به‌ طور معمول از محفظه شیشه‌ ای یا پلاستیکی شفاف تشکیل می‌ شود تا بتواند نور را نیز تا اندازه مورد نیاز دریافت کند.

مزایای کشت بافت گیاهان :

از مزایای کشت بافت تولید انبوه و سریع یک رقم مطلوب و یا رقم های جدید است . در گیاهان بذرهای تولید شده کاملا همانند گیاه مادر خود نیستند . همچنین این بذور با یکدیگر نیز تفاوت دارند . پس چنانچه یک گیاه مطلوب در منطقه ای توسط کشاورزان برگزیده شود و از آن بذر تهیه نمایند ، تضمینی وجود ندارد که بذور سبز شده ویژگی های مورد نظر را داشته باشند . همچنین از راه های معمول مانند قلمه زدن نیز نمی توان بسیاری از گیاهان را تکثیر کرد . اما با استفاده از روش های کشت بافت می توان در زمان کوتاه تعداد زیادی از یک گیاه مطلوب را تهیه نمود.

از مزایای کشت بافت تولید انبوه و سریع یک رقم مطلوب و یا رقم های جدید است . با استفاده از کشت بافت میتوان با روش هایی آلودگی ها بویژه ویروس را حذف نمود و از آن پس تمام گیاهان تولید شده عاری از آلودگی هستند.

تجهیزات آزمایشگاهی مورد استفاده در کشت بافت :

انکوباتور

ژرمیناتور

لامین­ایرفلو

شیکر ( تکان دهنده مکانیکی)

چراغ

گرمکن با همزن مغنا طیسی

دیگ بخار برای گرم کردن محیط کشت

ترازوی نیمه حساس برای توزین در حد گرم

ترازوی حساس برای توزین در میلی گرم

قاشقک برای استفاده در هنگام وزن کردن

مخلوط کن برای مقادیر زیاد محیط کشت

اجاق مایکرو ویو برای  گرم کردن سریع محیط کشت و مخلوط اگار (بجای گرمکن). از این اجاق برای ذوب کردن  مواد منجمد نیز استفاده میشود .

فیلتر های ظریف ( در حد میلی متر )

دستگاه تخلیه اتوماتیک

PH   سنج

دستگاه تقطیر

دستگاه یون زدایی

انواع مواد شیمییایی ( غالبا گران قیمت )

ساعت برای تنظیم زمان استریل کردن

جا لوله ای برای قرار دادن لوله های ازمایش در داخل اتو کلاو

ظروف فلزی جهت قرار دادن پتری دیش در داخل اتو کلاو

لوله ازمایش  فلاسک و ظروف پلاستیکی

وسایلی برای بستن درب لوله های ازمایش  و فلاسک ها ( چوب پنبه ورق نازک  آلومینیو می پلاستیک یا در پوش فلزی و امثال )

اتو کلاو یا دیگ زود پز

محلی برای نگهداری مواد شیمیایی و ظروف شیشه ای و غیره

یک محل استریل برای نگهداری محیط کشت و اب استریل و غیره

مخزن ذخیره (تانک) اب مقطر و آب بدون املاح

پی پت شور ( ضد اسید )

جدا سازی کشت ها:

اتاقک تمیز

منبع گاز در اتاقک تمیز

استریو میکروسکپ

چراغ بونزن برای تولید شعله ( یا چراغ الکلی )

دستگاه ضد عفونی خشک برای چاقو و چاقوی جراحی و گیره ( به جای چراغ بونزن)

فیلتر کاغذی ( در صورت امکان صفحات شیشه ای) برای استفاده در هنگام تهیه قلمه استریل.

پتری دیش برای وا کشت

سا نتریفوژ ( با دور کم )

هیپو کلریت برای ضد عفونی مواد گیاهی

الکل ۹۶ در صد

مخزن نسوز برای الکل

ورقه های نازک یا مواد مشابه برای پوشاندن جعبه ها و غیره

تجهیزات کلی:

آون جهت خشک کردن ظروف شیشه ای و غیره پس از استریل کردن

ظرف شویی اتو ماتیک

وسایل تنظیف ( برس و غیره)

معرف های شیمییایی

یخچال برای نگه داری مواد شیمییایی و محیط کشت

فریزر کوچک

وان ضد اسید حاوی اسید کرومیک و اسید سولفوریک برای شستشوی کامل ظروف شیشه ای آلوده

آون الکتریکی  (Oven)

pH متر  (pH meter)

هیتر استیرر   (Heater Stirrer)

اتوکلاو  (Autoclave)

ترازو   (Scale)

سردخانه یا یخچال  (Refrigerator)

پمپ تخلیه  (Vaccum Pump)

میکروسکوپ  (Microscope)

قفسه چوبی

هود لامینار

ابزار و وسایل شیشه ای

گلخانه  (Greenhouse)

محلول های مورد استفاده در محیط کشت

محلول پایه ماکرو المانها

محلول پایه میکرو المانها

محلول پایه اهن

محلول پایه ویتامین ها

محلول پایه اکسین و سیتوکسین

مواد و عناصر تشکیل دهنده محیط کشت بافت :

عناصر پرمصرف یا ماکروالمانها

عناصر پرمصرف شاملN ، P ،K  ،Mg  ، S و Ca می باشد که برای رشد ریزنمونه ضروری است .

نیتروژن یکی از عناصر پرمصرف است که به صورت یون های نیترات یا آمونیوم یا هر دو به محیط کشت اضافه می شود .

پتاسیم بصورت نمکهای KNO3  ، KH2PO4 و KCL به محیط کشت اضافه می شود . پتاسیم برای رشد سلولهای اکثر گیاهان لازم است .

فسفر بصورت نمکهای Na2H2Po4 یا KH2Po4 در محیط کشت وجود دارد .

کلسیم بصورت CaCl2 و CaNo3 مصرف می شود .

منیزیم محیط کشت با افزودن نمک MgSo4 تامین می شود .

عناصر کم مصرف یا میکروالمانها

عناصر کم مصرف مورد نیاز سلول های گیاهی شامل Mn  ، Zn  ، Cu  ،  B ، Co  ، I و Mo می باشد .

منگنز بصورت نمک MnSo4 به محیط کشت اضافه می شود .

روی محیط کشت با افزودن نمک ZnSo4 تامین می شود .

مس به صورت CuSo4 به محیط کشت اضافه می شود .

بر بصورت H3BO3 به محیط کشت اضافه می شود .

کبالت بصورت CoCl2 به محیط کشت اضافه می شود .

ید بصورت KI به محیط کشت اضافه می شود .

مولیبدن بصورت Na2MoO4 به محیط کشت افزوده می شود .

محلول ساز:

به منظور بررسی اثرات سطوح مختلف غلظتی فاکتور های رشد بر

پارامترهای رشد انواع کالوس تولید شده در گیاه از محیط کشتMS  به عنوان محیط پایه استفاده می شود .

برای تهیه محیط کشت معمولاً محلولهای مادر یا پایه تهیه میشوند .

برای هرکدام از عناصر ماکرو ، میکرو و آهن ، بایستی محلولهای ذخیره یا استوک ها به صورت جداگانه تهیه شوند .

استوک ماکرو معمولاًً با غلظت ۱۰ یا ۲۰ برابر

محلول پایه عناصر میکرو و آهن و ویتامین ها : با غلظت۱۰۰ یا۲۰۰  برابر تهیه میشوند .

محلول پایه ماکرو المانها ( x 20 )

برای تهیه یک لیتر از استوک ماکرو المانها
NH4NO3	۳۳ گرم در لیتر
KNO3	۳۸ گرم در لیتر
MgSO4.7H2O	۴٫۷  گرم در لیتر
KH2PO4	۴٫۳گرم در لیتر
CaCl2.2H2O	۸٫۸ گرم در لیتر

مقادیر ذکر شده ذیل وزن شده

هرکدام  به صورت جداگانه در حدود ۷۵ میلیلیتر آب ۲بار تقطیر حل شده ،

در نهایت حجم محلول با آب دو بار تقطیر به یک لیتر رسانده در یخچال دمای ۴ درجه نگهداری شود .

محلول پایه میکروالمانها  (x 200)
MnSO4.H2O	۳۳۸۰ میلی گرم در لیتر
ZnSO4.7H2O	۱۷۲۰  میلی گرم  در لیتر
Na2MoO2.7H2O	۵۰  میلی گرم در لیتر
CuSO4.5H2O	۵  میلی گرم در لیتر
CoCl2.6H2O	۵  میلی گرم در لیتر
H3BO3	۱۲۴۰ میلی گرم در لیتر
KI	۱۶۶  میلی گرم در لیتر

برای تهیه یک لیتر از استوک میکرو المانها (x200)

مقادیر ذکر شده از مواد ذیل وزن شده ، در حدود ۶۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل شده ، در نهایت حجم محلول با آب دو بار تقطیر به یک لیتر رسانده شده ، در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شود .

محلول آهن (x 200)

برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر محلول پایه آهن (x 200)،

۷۴۴ میلی گرم از   Na2EDTA.2H2O در حدود

۷۵ میلی لیتر آب دوبار تقطیر جوشان حل شده ، سپس به تدریج ۵۵۶ میلیگرم FeSO4.7H2O به محلول حاصله اضافه شود ، یک ساعت به طور منظم هم زده شود ،        تا محلول شفاف  شده و به رنگ زرد طلایی در آید ، سپس با آب دو بار تقطیر به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شده ، در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری گردید .

محلول ویتامین ها
Myo-Inositol	۲۰۰۰  میلی گرم در لیتر
Nicotinic Acid	۱۰  میلی گرم در لیتر
Pyridoxine.HCL	۱۰ میلی گرم در لیتر
Thiamin.HCl	۲ میلی گرم در لیتر
Glycine	۴۰  میلی گرم در لیتر

برای تهیه محلول پایه ویتامین ها مقادیر ذیل وزن شده  و در حدود ۶۰ میلی لیتر آب مقطر حل گردید . پس از حل شدن کامل مواد حجم نهایی به ۱۰۰ میلی لیتر رسانیده شد . این محلول در حجم های پنج میلی لیتر در ظروف ویال ، تقسیم شده و در یخچال دمای ۲۰-  نگهداری شود . در نهایت هر کدام ، برای تهیه یک لیتر محیط کشت MS  استفاده گردید .

محلول اکسین و سیتوکینین

برای تهیه محلول پایه اکسین ( D -4,2 )  و محلول پایه سیتوکینین ( بنزیل آمینو پورین BA یاBAP ) پنج ( ۵ ) میلی گرم از هریک از این هورمون ها وزن شد . برای حل شدن کامل  ( D -4,2 )در آب یک الی چند قطره( NaOH 0/1 ) نرمال اضافه نموده و سپس با مقداری آب دوبار تقطیرحل میشود ، و حجم نهایی این محلول با آب دو بار تقطیر به ۵۰ میلی لیتر رسانیده میشود .

برای حل شدن کامل ( BAP ) از یک الی چندقطره(HCl   ۰/۱ ) نرمال استفاده میشود و مشابه روش فوق حجم محلول نهایی با آب دوبار تقطیر به ۵۰ میلی لیتر رسانیده میشود .

در این صورت غلظت محلول مادر  (D-4,2 ) و (  ( BAP، ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر شده و هرگاه یک میلی لیتر از این محلول به ۵۰ میلی لیتر محیط کشت افزوده شود .  غلظت هورمون مورد نظر در این محیط کشت ۲ میلی گرم بر لیتر خواهد شد .

تنظیم کننده های رشد گیاهی

 چندین گروه از تنظیم کننده های رشد گیاهی در کشت بافت از اهمیت زیادی برخوردار هستند . این تنظیم کننده ها شامل اکسین ها ، سیتوکینین ها ، جیبرلین ها ، اسید آبسزیک و اتیلن می باشند . در کشت درون شیشه ای اسکین ها و سیتوکنین ها نقش بیشتری دارند . مصرف اکسین ها و سیتوکنین ها در محیط کشت بستگی به نوع ریز نمونه و گونه گیاهی دارد .

اکسین ها شامل اسید ایندول استیک ، اسید ایندول بوتیریک ، اسید نفتالین استیک ، اسید فنل استیک ، اسید و  دی کلروفنوکسی استیک ، اسید تری کلروفنوکسی استیک ، اسید پیکولینیک ، اسید و دی کلر و فنوکسی بنزوئیک ، اسید پی ـ کلروفنوکسی استیک می باشند که در تشکیل ریشه نابجا ( در غلظت بالا ) ، تشکیل ساقه نابجا ( در غلظت کم ) ، القای جنین سماتیک ، تقسیم سلولی ، تشکیل و رشد کالوس ، جلوگیری از رشد جوانه جانبی و جلوگیری از رشد ریشه نقش دارند .  ( TIBA ) اسید تری یدوبنزئیک  و (NPA)   اسید ان نفتیل فتالامیک  از انتقال قطبی اکسین جلوگیری می کنند . (PCIB) پی ـ کلرو فنوکسی اسید ایزوبوتیریک  با پیوند شدن با گیرنده های اکسین از فعالیت آن جلوگیری می کند و ترکیبات فنولیک ( مانند اسیدفرولیک یا فلوروگلوسینول ) از اکسیداسیون اکسین جلوگیری می کنند . ریبوفلاوین اکسیداسیون نوری (IBA) و (IAA) را تشدید می کند .

سیتوکنین ها شامل زآتین ، زآتین ریبوزید ، ایزوپنتیل آدنین ، بنزیل آمینو پورین ، تیدیازورون  ، ان کلرو پیریدیل ، ان فنیل اوره می باشند که در تشکیل شاخه نابجا ، جلوگیری از تشکیل ریشه ، تقسیم سلولی ، تشکیل و رشد کالوس ، تحریک رشد جوانه جانبی ، جلوگیری از رشد طولی شاخه و جلوگیری از پیری برگ مؤثر هستند . ترکیباتی به نام لواستاتین

( Lovastatin )  شناخته شده اند که از سنتز سیتوکنین جلوگیری می کنند .

جیبرلین ها شامل اسید جیبرلیک ( GA3 )  ، جیبرلین ۱  GA1 )، جیبرلین (GA4 )4 و جیبرلین GA7 ) 7 ) می باشند که باعث رشد طولی شاخه ، رفع درمانسی ( بذر ، جنین ، سماتیک ، جوانه انتهایی ، سوخ ) و جلوگیری از تشکیل ریشه نابجا می شوند . پکلوبوترازول و آنسیمیدول مانع سنتز جیبرلین و در نتیجه کوتاه شدن شاخه می شوند .

اتیلن سبب پیری برگ ، رسیدگی میوه  ، تحریک یا بازدارنده تشکیل اندام های نابجا ( بسته به زمان مصرف یا ژنوتیپ ) می شود . آمینوسیکلوپروپان ، اسید کربوکسیلیک ( ACC )  پیش ماده سنتز اتیلن است و توسط بافت های گیاهی به اتیلن تبدیل می شود . آمینو اتوکسی و ینیل گلیسین

( AVG )  از سنتز اتیلن جلوگیری می کند و نقره که به صورت تیوسولفات نقره مصرف می شود ، از عمل اتیلن جلوگیری می کند .

مواد جامد کننده محیط کشت

آگار  ( Agar )  یکی از مواد جامد کننده ای است که از نوعی علف هرز دریایی ( جلبک قرمز ) بدست می آید . اگرچه آگار دارای منشا گیاهی است ، اما باید خالص شود بطوری که هیچ ماده سمی در آن وجود نداشته باشد . آگار یک پلی ساکارید با وزن مولکولی بالاست که در اثر افزودن آب به آن قدرت تولید ژل را پیدا می کند . آگار در دمای حدود ۴۰ سانتیگراد جامد می شود . در دمای بیش از ۸۵ درجه سانتیگراد مجددا ذوب می گردد و در دمای ۱۰۰ درجه سانتیگراد حل می شود . مقدار مصرف آگار تقریباً ۸/۰ درصد ( ۸ گرم در لیتر محیط کشت ) می باشد .

اگرچه آگار باعث جامد شدن محیط کشت و نگهداری ریز نمونه می شود  ، اما عدم وجود هوای کافی در آن گاهی باعث صدمه به ریز نمونه می گردد .

آگار دارای کلسیم ، پتاسیم ، منگنز و سدیم است که موجب تغییر غلظت آن می شود و ممکن است بر روی قابلیت جذب مواد غذایی اثر بگذارد . به علاوه آگار حاوی هیدرات کربن ، اسید آمینه و ویتامین است .

تنظیم پی اچ (PH)

قبل از اینکه آگار (منعقد کننده) را اضافه کنیم باید پی اچ را روی ۵٫۵ تا ۵٫۸ تنظیم کرد . عمل تنظیم پی اچ با استفاده از هیدروکسید سدیم ۰٫۱ مولار انجام می شود . عمل تنظیم پی اچ بسیار مهم است . چون اگر پی اچ محیط کشت بالاتر از ۶ باشد ، رشد مطلوبی صورت نمی گیرد و اگر پی اچ خیلی پایین رود اکسین و جیبرلین ناپایدار می شود ، ویتامین تیامین ناپایدار ،  محیط کشت آبکی و احتمال ویتریفیکاسیون بیشتر می شود .

پس از تنظیم پی اچ  ، آگار را اضافه می کنیم ، البته دقت شود که قبل از اضافه کردن آگار ، حتما محیط کشت را حرارت دهید ( تا نزدیک نقطه جوش) تا حلالیت آگار بیشتر شود .

پس از اضافه کردن آگار ، توسط همزن مواد را مخلوط می کنیم تا تا محلولی شفاف به دست آید . حال محیط کشت را به درون ویال ها ( شیشه های مورد استفاده) انتقال می دهیم و نهایتا ویال ها را در دستگاه اتوکلاو ( به منظور استریل کردن) قرار می دهیم .

استریل کردن محیط کشت و محلول ها

عموما محیط کشت توسط اتوکلاو استریل می شود . در اتوکلاو با دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد و به مدت ۱۵ الی ۳۰ دقیقه استریل میکنیم .

روش استریل کردن ظروف شیشه ای

بهتر است ظروف مورد استفاده پیرکس باشد چون که ظروف شیشه ای ارزان قیمت منجر به تولید مواد سمی می گردند .

ضد عفونی کردن ظروف توسط دستگاه اتوکلاو انجام میشود .

روش استریل سازی ریز نمونه :

ریز نمونه را توسط آب به خوبی شستشو می کنیم . پس از رفع آلودگی های ظاهری ریز نمونه را در الکل اتانول ۷۰%  به مدت ۳۰ تا ۶۰ ثانیه ( بسته به نوع ریزنمونه ) ،  قرار می دهیم . اگر ریز نمونه بذر باشد ، مدت بیشتری نسبت به ریز نمونه برگ در الکل می گذاریم . ( ریز نمونه خشبی نیز بیشتر در الکل باقی بماند ) باید دقت شود که نگهداری ریز نمونه به مدت زیاد در اتانول ، ریز نمونه رشد و باز زایی نمی کند .

سپس ریز نمونه را با آب مقطر می شوئیم ، در محلول هیپوکلریت سدیم ( وایتکس ۱ تا ۵ درصد ) به مدت ۵ تا ۳۰ دقیقه قرار می دهیم . سپس چندین بار ریز نمونه را با آب مقطر می شوئیم تا کاملا هیپوکلریت سدیم از ریزنمونه زدوده شود . حال ریز نمونه به درون هود لامینار انتقال می یابد .

نکته : در هنگام استریل سازی نمونه با هیپوکلریت سدیم ، از مواد کاهنده کشش سطحی ( یک قطره مایع ظرفشویی ) استفاده می کنیم تا سطح تماس ریز نمونه با ماده ضدعفونی کننده افزایش یابد .

▼ توجه به نکات زیر در هنگام اتوکلاو نمودن محیط کشت ضروری است :

( PH )  پی اچ محیط کشت بعد از اتوکلاو نمودن ، ۰٫۳ تا ۰٫۵ کاهش می یابد یعنی محیط کشت کمی اسیدی تر می شود .

اتوکلاو کردن طولانی مدت سبب رسوب برخی نمک ها و تجزیه آگار و قند ها می شود .

مواد فرار از قبیل اتر ، اتیلن و … در اثر اتوکلاو نمودن از بین می روند .

استرلیزاسیون لوازم فلزی :

 از قبیل پنس و اسکالپل : این گونه وسایل را جهت ضد عفونی ، در دستگاه آون در دمای ۱۷۰ تا ۱۸۰ درجه سانتیگراد به مدت ۳ ساعت قرار می گیرند .

با استفاده از ا اشعه ماوراء بنفش می توان هود لامینار را ضد عفونی کردد. همچنین کف هود لامینار را با الکل ۹۶ درصد ضد عفونی می کنند . لازم به ذکر است که پنس ها ، چاقو ها و دیگر لوازم فلزی را در زیر هود لامینار دو بار در الکل ۷۰ درصد به مدت چند ثانیه فرو می برند و سپس بر بروی شعله می گیرند تا کاملا استریل گردد .

اگر با وجود ضد عفونی و استریل سازی ریزنمونه ، آلودگی مشاهده شد یکی از عوامل زیر مسئول می باشند :

آلودگی های داخلی بافت

بی دقتی در کار و یا ضد عفونی نکردن میز یا هود لامینار

الکل آلوده

صحبت کردن در زیر هود لامینار

رفت و آمد زیاد به اتاق کشت

مراحل اصلی انجام کشت بافت های گیاهی:

۱) تهیه ریز نمونه و استریل سازی آن

۲) انتقال ریز نمونه به محیط کشت در زیر هود لامینار

۳) رشد گیاه در محیط کشت تحت شرایط کنترل شده

۴) واکشت کردن ریز نمونه ها

۵) سازگار کردن ریزنمونه ها با شرایط برون شیشه ای  (invivo)

۶) انتقال گیاه به شرایط برون شیشه ای

جدا کردن و انتقال ریز نمونه استریل به درون محیط کشت:

مقداری از ریز نمونه را بریده ، در زیر هود لامینار به محیط کشت اضافه می کنیم . لوله های آزمایش و یا ظروف شیشه ای حاوی محیط کشت بایستی افقی نگه داشته شود و از قرار دادن ظروف محیط کشت بر روی شعله در حین انتقال نمونه خودداری شود ، زیرا شعله تولید اتیلن می کند . معمولا بذور را بر روی سطح محیط کشت و اندام های گیاهی را درون محیط کشت قرار می دهند.

رشد گیاه در محیط کشت تحت شرایط کاملا کنترل شده

دمای محیطی که محیط کشت های حاوی ریز نمونه ها در آن قرار دارند ، باید ۲۴ تا ۲۸ درجه سانتیگراد باشد ( البته در مواردی مانند گونه های پیاز دار ، شکستن خواب و یا جوانه زنی ، دمای کمتری را انتخاب می کتتد ) .از لامپ های فلورسنت برای تامین نیاز نوری گیاه بهره می گیرند ، نور بالاتر از ۱۰۰۰۰ لوکس مفید نمی باشد . چون نور زیاد ، PH  محیط کشت را پایین می آورد و محیط کشت را آبکی می کند . دما را بالا می برد و اثرات منفی بر روی رشد گیاه ایجاد می کند.

در برخی موارد کنترل طول روز نیز حائز اهمیت است . فرایند هایی نظیر گلدهی و خواب به طول روز حساس هستند . تشعشع پایین را می توان با اضافه کردن قند به محیط کشت جبران کرد . رطوبت اتاق رشد ( گراس چمبر) در شرایط کنترل شده قرار دارد . هرچند به دلیل بسته بودن درب ویال ها ، رطوبت اتاق تاثیر چندانی بر محیط کشت ندارد .

اکسیژن مورد نیاز ریز نمونه را می توان با استفاده از سرپوش های فلزی برای ویال ها و همچنین قرار دادن ریز نمونه به صورت واژگون در محیط کشت ، استفاده از محیط کشت مایع ، تامین کرد.

اتاق کشت:

واکشت کردن ریز نمونه ها:

جدا کردن قطعه ای از ریز نمونه موجود در محیط کشت و کشت کردن مجدد آن در محیط کشت جدید را واکشت کردن می گویند. علت انجام این عمل عبارتست از:

کاهش مواد غذایی در محیط کشت اول

بالا رفتن غلظت نمک ها و خشک شدن محیط کشت اول

پر شدن فضا در اثر رشد گیاه در محیط کشت اول

ترشح مواد سمی و فنولی توسط گیاه به محیط کشت اول

کاهش PH و آبکی شدن محیط کشت اول

نکته : گاهی اوقات هدف از واکشت کردن ، به همراه تغییر در میزان هورمون ها ی اکسین و سیتوکینین ، تولید اندام ریشه یا ساقه می باشد.

نکته : گیاهانی که در شرایط درون شیشه ای رشد کرده اند ، ریشه های موئین بسیار کم و ضعیفی تولید کرده اند . یکی از بهترین کار هایی که به منظور توسعه ریشه ها استفاده می شود ، استفاده از محیط کشت مایع است.

سازگار کردن ریزنمونه ها با شرایط برون شیشه ای ( invivo )

از آنجایی که ریز نمونه ها در شرایط درون شیشه ای با رظوبت بالا رشد کرده اند ، بهبود مکانیسم باز و بسته شدن روزنه ها ، یکی از مهمترین فواید سازگاری گیاهان است در هنگام انجام عملیات سازگاری یا خودهی ، دما و نور را پایین و رطوبت را بالا نگه می داریم.

مراحل انتقال گیاه خو گرفته به شرایط برون شیشه ای

آگار از اطراف گیاه کاملا شسته شود.

انتقال به درون خاک کاملا استریل ( خاک را معمولا با آون ، بخار آب و یا اشعه استریل می کنند)

گیاهانی که در آنها پیاز های حقیقی یا کاذب وجود دار ، باید به فرم پیاز از ویال به درون خاک منتقل شود تا احتمال بقای گیاه بالاتر رود.

گاهی اوقات لازم است به منظور شکستن خواب گیاه ، بلافاصله پس از کشت گیاه در خاک به آن مقداری سرما بدهیم.

از انواع کشت بافت می توان به موارد زیر اشاره کرد :

۱- کشت گیاه کامل : یک بذر ممکن است در شرایط آزمایشگاهی کشت شود و یک گیاهچه و در نهایت یک گیاه کامل تولید کند .

۲- کشت جنین : در این نوع کشت جنین جدا شده پس از حذف پوسته بذر کشت میشود.

 ۳- کشت اندام گیاهی : یک اندام جدا شده در شرایط این ویترو رشد میکند . در کشت اندام انواع مختلفی مثل کشت مریستم  کشت نوک ساقه کشت ریشه کشت پرچم و غیره قابل تشخیص هستند . غالبا قسمت جدا شده (بافت یا اندام)به عنوان قلمه شناخته شده و کشت قلمه نامیده میشود.

 ۴- کشت کالوس : اگر یک بافت تمایز یافته جدا شود و در شرایط این ویترو  تولید یک توده سلولی تمایز نیافته بنام کالوس  نماید این پدیده را کشت کالوس می نامند.

 ۵- کشت سلول : کشت سلول های منفرد  که به کمک انزیم ها یا به روش های مکانیکی از یک بافت گیاهی  کالوس یا سوسپانسیون سلولی به دست می ایند کشت سلول نامیده میشوند.

 ۶- کشت پروتو پلاست : کشت پروتو پلاست هایی که در اثر هضم انزیمی دیواره سلول به وجود امده اند کشت پرو تو پلاست می نامند.

نتیجه گیری :

با توجه به اهمیت برخی گونه های دارویی و گیاهی و کندی تکثیر آنها به روش های سنتی ، تکثیر آنها از طریق کشت اندام و کشت کالوس و کشت جنین علاوه بر اقتصادی بودن ، از نظر زمانی نیز بسیار کوتاه تر است.

جمع بندی :

کشت بافت به دلیل مزایای فراوانی که دارد در دهه‌های اخیر موردتوجه بسیاری از کشاورزان و تولیدکنندگان قرارگرفته است. از مهم‌ترین مزیت‌های این روش کشت در گیاهان نسبت به روش‌های سنتی مانند کشت مستقیم بذر و قلمه زدن می‌توان به موارد زیر اشاره کرد :

 تولید تیراژ بسیار زیاد از تعداد کمی گیاه در مدت‌زمان کوتاه

انتقال خصوصیات گیاه مادر به نسل‌های بعدی در اصلاح نباتات و تولید گیاهان هیبرید

تولید گیاهان عاری از باکتری و ویروس و احیا گیاهان در معرض انقراض

گیاهان زینتی مانند رز هلندی، گل محمدی، استویا و گیاهان آکواریومی در اکثر مناطق دنیا با روش کشت بافت تکثیر می‌شوند.

کاکتوس ها و ساکولنت ها را نیر میتوانید با روش کشت بافت تکثیر کنید.

منابع :

 ۱ ـ خوشخوی م . ۱۳۷۷ . فنون کشت بافت گیاهی برای گیاهان باغبانی ، انتشارات دانشگاه شیراز .

 ۲ ـ وصال ، باقری . ۱۳۸۲ . عملیات کشت بافت گیاهی از انتشارات دانشگاه امام رضا .

 ۳ ـ باقری ، صفاری . ۱۳۷۶ . مبانی کشت بافت های گیاهی از انتشارات دانشگاه فردوسی .

۴ ـ پیری ، نصریان فیروز آبادی . ۱۳۸۰ . راهنمای کشت بافت گیاهی ، انتشارات دانشگاه بوعلی سینا همدان .

 ۵ ـ حسین دخت . م . ر. ۱۳۸۰ . بررسی تولید گیاهان هاپلویید ، انتشارات دانشگاه تهران .

۶ ـ حسین دخت . م . ر . ۱۳۸۵ . مبانی کشت بافت گیاهی ، انشارات دانشگاه تربیت مدرس

نویسنده : محسن خردمند (کارشناس کشاورزی )